In 1568 werd hij tot priester gewijd. Door verzwakkende houding en "falende" leefgewoonten in de Karmelietenorde, overwoog hij zijn orde te verlaten en in te treden bij de strengere Kartuizers. Toen ontmoette hij de heilige Theresia van Avila en begon hij met de hervorming van zijn orde. De Ongeschoeide Karmelieten. Hij bleef zijn orde trouw en werd door de karmelieten die de hervormingen niet wilde doorvoeren en zich aangevallen voelden, vastgenomen en zwaar mishandeld. Johannes bleef echter trouw aan de visie van Theresia en in 1578 wist hij te vluchten naar het klooster Calvario. de scheiding tussen de Geschoeide en Ongeschoeide Karmelieten was nu definitief.
Toen de heilige Theresia in 1582 stierf moet Johannes het gemeenschappelijk werk alleen voortzetten. Vanaf 1588 was hij prior van het Vaderhuis van de Ongeschoeide karmelieten in Segovia.
In zijn laatste levensjaren heeft hij veel lichamelijk lijden te verduren gehad. Hij is op 14 december 1591, slechts negenenveertig jaar oud, in het klooster van Ubeda gestorven. Twee jaar later werd zijn lichaam overgebracht naar Segovia. Op 26 december 1726 werd Johannes van het Kruis door paus Benedictus XIII heilig verklaard. Hij behoort tot de grootste leraren van de mystiek. Paus Pius Xl heeft hem vooral om de volgende mystieke geschriften in 1926 verheven tot kerkleraar;
"Bestijging van de Berg Karmel", "Duistere nacht van de ziel", "Doornen van de geest", "Levende Vlam van liefde", "Geestelijke beurtzang tussen de ziel en Christus".
De fundamentele uitspraken van Vaticanum II zijn soms de letterlijke vertalingen uit de werken van Johannes van het Kruis.